MicroRNA (miRNA) 研究方法全面总结
miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链小RNA,在转录后水平通过靶向mRNA的3'非翻译区（3' UTR）来降解靶基因或抑制其翻译，从而在细胞增殖、分化、凋亡、代谢等几乎所有生命活动中发挥关键的调控作用，miRNA的异常表达与多种疾病（尤其是癌症）的发生发展密切相关，因此成为当前生命科学和医学研究的热点。
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以下是miRNA研究的系统性方法总结,通常遵循以下逻辑链条：发现差异表达 → 功能预测与验证 → 机制深入探讨 → 临床转化应用。
第一部分：miRNA的发现与差异表达分析
这是miRNA研究的起点,旨在从海量miRNA中筛选出与特定生物学过程或疾病状态相关的候选miRNA。
高通量筛选技术
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A. 微阵列芯片
- 原理： 将已知的miRNA探针固定在芯片上，用荧光标记的待测样本（如组织、细胞总RNA）进行杂交，通过检测荧光信号的强度来定量分析miRNA的表达水平。
- 优点：
- 通量高,可一次性检测成百上千种miRNA。
- 成本相对较低。
- 技术成熟,数据可比性强。
- 缺点：
- 灵敏度有限,对于低丰度miRNA检测效果不佳。
- 只能检测已知miRNA,无法发现新的miRNA。
- 存在交叉杂交风险。
- 应用： 大样本量的miRNA表达谱筛选，如寻找癌症生物标志物。
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B. RNA测序
（图片来源网络，侵删）- 原理： 将样本中的总RNA（或小RNA组分）构建成cDNA文库，然后进行高通量测序，通过生物信息学分析，将测序序列与已知miRNA数据库比对，即可得到miRNA的表达谱和定量信息，还能发现新的miRNA。
- 优点：
- 灵敏度极高，可检测到丰度极低的miRNA。
- 动态范围广，能准确区分表达量差异大的miRNA。
- 无偏性，不仅能检测已知miRNA，还能发现新的miRNA。
- 能提供miRNA的异构体信息。
- 缺点：
- 成本较高。
- 数据分析流程复杂,对生物信息学能力要求高。
- 需要大量起始RNA（但已有针对微量样本的建库方案）。
- 应用： 当前的金标准，适用于差异表达分析、新miRNA发现、miRNA编辑等研究。
特定miRNA的定量验证
高通量筛选后,需要对候选miRNA进行精确的定量验证。
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A. 茎环法实时荧光定量PCR (Stem-loop RT-qPCR)
- 原理： 使用带有特殊茎环结构的逆转录引物，将成熟的miRNA逆转录成较长的cDNA，然后设计特异性正向引物和通用反向引物进行qPCR检测。
- 优点：
- 特异性极高，能有效区分成熟miRNA和其前体pri-miRNA/pre-miRNA。
- 灵敏度极高，可检测到单个细胞水平的miRNA。
- 准确性好,重复性高。
- 缺点：
- 一次只能检测一个miRNA,通量低。
- 需要针对每个miRNA设计特异性引物。
- 应用： 差异表达验证的金标准，适用于少量关键miRNA的精确定量。
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B. 探针法实时荧光定量PCR (TaqMan Probe-based RT-qPCR)
- 原理： 与茎环法类似，但使用TaqMan探针（带有荧光报告基团和淬灭基团）进行检测，探针与目标cDNA特异性结合，PCR延伸时探针被降解，报告基团释放荧光。
- 优点：
- 特异性与茎环法相当。
- 可以设计多重荧光通道,实现多重检测。
- 缺点：
成本高于茎环法。
（图片来源网络，侵删） - 应用： 特别适合需要同时检测多个miRNA或内参基因的场景。
第二部分：miRNA的功能研究
找到差异表达的miRNA后,需要研究其在细胞或生物体中的生物学功能。
miRNA功能获得
- 方法：miRNA模拟物 / miRNA前体
- 原理： 将化学合成的成熟miRNA双链模拟物或能表达成熟miRNA的质粒载体转染/导入细胞，使其在细胞内过表达，从而模拟miRNA高表达状态。
- 应用： 研究miRNA过表达对细胞表型（如增殖、凋亡、迁移、侵袭等）的影响，或验证其对靶基因的抑制作用。
miRNA功能缺失
- 方法：miRNA抑制剂 / Antagomirs
- 原理：
- 化学合成抑制剂： 设计与成熟miRNA序列互补的单链寡核苷酸（如Antagomirs, LNA-antimiR），通过其“诱饵”作用，特异性地结合并中和内源的miRNA，使其无法与靶基因结合。
- 海绵载体： 构建一个表达载体，载体上串联多个与目标miRNA完全互补的“结合位点”（即miRNA Response Elements, MREs），当该载体在细胞中表达时，会产生大量的“miRNA海绵”，像海绵一样吸附内源的miRNA，从而抑制其功能。
- 应用： 研究抑制特定miRNA后对细胞表型的影响，或验证其在特定通路中的必要性。
- 原理：
第三部分：miRNA下游靶基因及机制研究
这是miRNA研究的核心,即阐明miRNA“调控了什么”。
生物信息学预测
- 原理： 基于miRNA与靶基因结合的核心规则（如种子序列匹配、结合自由能等），利用算法预测miRNA的潜在靶基因。
- 常用数据库/工具： TargetScan, miRanda, PicTar, miRDB, starBase等。
- 注意： 预测结果必须通过实验验证！ 任何一种算法都存在假阳性。
实验验证
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A. 双荧光素酶报告基因实验
- 原理： 将目标基因3' UTR中预测的miRNA结合序列（野生型）克隆到荧光素酶报告载体下游，构建一个突变体载体，将结合序列中的关键碱基进行突变，将这两种载体分别与miRNA模拟物或共转染到细胞中，如果miRNA能靶向该3' UTR，则野生型载体的荧光素酶活性会显著下降，而突变体则不受影响。
- 优点： 直接、快速地验证miRNA与靶基因3' UTR的直接结合关系。
- 缺点： 只能验证结合，不能完全反映在细胞内真实的调控效果（可能受其他因素影响）。
- 应用： 验证靶基因的金标准。
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B. Western Blot / qPCR
- 原理： 在过表达miRNA模拟物或抑制miRNA的细胞中，通过Western Blot检测靶蛋白水平的变化，或通过qPCR检测靶mRNA水平的变化。
- 解读：
- 如果miRNA导致靶mRNA和蛋白水平同时下降，说明该miRNA主要通过降解靶mRNA发挥作用。
- 如果只导致靶蛋白水平下降，而mRNA水平不变，说明该miRNA主要通过抑制翻译发挥作用。
- 应用： 验证miRNA对靶基因的调控效果，并初步判断其作用机制。
全局靶基因筛选
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A. AGO免疫共沉淀测序
- 原理： miRNA与其靶mRNA形成RNA诱导沉默复合物，核心蛋白是Argonaute (AGO)，利用特异性抗体将AGO蛋白及其结合的mRNA（即miRNA的靶mRNA）共沉淀下来，然后对这些mRNA进行测序分析。
- 优点： 无偏性地、在细胞内生理状态下，直接捕获所有被特定miRNA调控的靶基因。
- 缺点： 技术要求高，成本高。
- 应用： 在全基因组范围内寻找miRNA的直接靶基因，常用于新miRNA的功能机制研究。
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**B. 蛋白质
